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2×GoldStar Best MasterMix（無染料）說明書
貨號：K0656
保存條件：-20℃長期保存，如需頻繁使用，可存放于2-8℃，盡量避免反復凍融。
組分說明
Cat. No. K0656 K0656B
Kit Size 1 ml 5×1 ml
2×GoldStar Best MasterMix 1 ml 5×1 ml
RNase-Free Water 1 ml 5 ml
注意：2×GoldStar Best MasterMix含有GoldStar Best DNAPolymerase,
2×GoldStar Best PCR Buffer, 3 mM MgCl2和400 µM dNTPs。
產(chǎn)品簡介
本品為由GoldStar Best DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg、dNTPs以及PCR穩(wěn)定劑和增強劑組成的預混體系，濃度為 2×，具有操作簡便快速、靈敏度高、特異性2+強、穩(wěn)定性好的優(yōu)點，可最大限度地減少人為誤差和污染。該產(chǎn)品所含的 GoldStarBest DNA Polymerase是經(jīng)過特殊處理的熱啟動高保真聚合酶。該聚合酶具有5′-3′DNA聚合酶活性，5′-3′核酸外切酶活性和 3′-5′核酸外切酶活性，在普通PCR條件下，與GoldStar Taq DNA Polymerase相比，具有擴增效率高、錯配率低的優(yōu)良性能。化學修飾使該酶在常溫下沒有聚合酶活性，有效避免在常溫條件下由引物和模板非特異性結合或引物二聚體而產(chǎn)生的非特異性擴增，酶的激活須在 95℃下孵育10分鐘，該條件可以整合入已有的PCR熱循環(huán)程序。優(yōu)化的緩沖體系使酶的作用發(fā)揮最大功效，實現(xiàn)對目的片段的高保真、高特異性、高擴增效率、高靈敏度擴增。本品不含染料，PCR程序結束后可根據(jù)需要加入適量上樣緩沖液后進行電泳操作。擴增得到的 PCR產(chǎn)物3′端附有一個“A"堿基，因此可直接用于 T/A克隆。適用于常規(guī)的 PCR反應和對高保真性有要求的基因克隆等實驗。
質(zhì)量控制
經(jīng)檢驗無外源核酸酶活性； PCR方法檢測無宿主殘余DNA；能有效地擴增多種基
因組中的單拷貝基因；2-8℃存放三個月，活性無明顯改變。
本產(chǎn)品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途
使用方法
以下舉例為常規(guī)PCR反應體系和反應條件，實際操作中應根據(jù)模板、引物結構和目的
片段大小不同進行相應的改進和優(yōu)化。
1. PCR反應體系
試劑 50 μl反應體系 終濃度
2×GoldStar Best MasterMix 25 μl 1×
Forward Primer，10 µM 2 μl 0.4 μM
Reverse Primer，10 µM 2 μl 0.4 μM
Template DNA <1 μg <1 μg/reaction
RNase-Free Water up to 50 μl
注意：引物濃度請以終濃度0.1-1.0 μM作為設定范圍的參考。擴增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應時，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應體系。
2. PCR反應條件
步驟 溫度 時間
預變性 95℃ 10 min
變性 94℃ 30 s
退火 55-65℃ 30 s 30-40個循環(huán)
延伸 72℃ 60 s
終延伸 72℃ 5 min
注意：1）一般實驗中退火溫度比擴增引物的熔解溫度Tm低5℃，無法得到理想的擴增效率時，適當降低退火溫度；發(fā)生非特異性反應時，提高退火溫度，由此優(yōu)化反應條件。
2）延伸時間應根據(jù)所擴增片段大小設定，本產(chǎn)品中所包含的GoldStar Best DNA Polymerase的擴增效率為1 kb/min。
3）可根據(jù)擴增產(chǎn)物的下游應用設定循環(huán)數(shù)。如果循環(huán)次數(shù)太少，擴增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，錯配機率會增加，非特異性背景嚴重。所以在保證產(chǎn)物得率的前提下應盡量減少循環(huán)次數(shù)。
4）本產(chǎn)品須在預變性95℃，10 min條件下實現(xiàn)酶的活化。
3.結果檢測：本產(chǎn)品不含染料，反應結束后，取5 µl反應產(chǎn)物加入適量上樣緩沖液后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
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