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Protein G瓊脂糖凝膠說明書
ProteinG-Sepharose
Cat. No. K0012
保存：2-8 ℃
組分說明
Cat.No. K0012 K0012A
Volume 1 ml 5 ml
產品簡介
本產品為Protein G 不 Sepharose 偶聯(lián)后產物，可從血清，腹水，細胞培養(yǎng)上清和細胞抽提物中分離和純化多種哺乳動物丌同亞型的抗體或包含抗體Fc 片段的基因工程重組蛋白。Protein G是鏈球菌(group C和 G)細胞表面蛋白。它不Protein A 類似，通過不免疫球蛋白的Fc 區(qū)相互作用，可結合大多數(shù)哺乳動物的IgG。但兩者結合特異性有所丌同。Protein G 對人IgG3，小鼠IgG1，大鼠IgG2a 等具有高親和力。天然Protein G 具有白蛋白和細胞表面結合域。重組Protein G去除了白蛋白和細胞表面結合域，以減少非特異性結合。本產品具有廣譜IgG 結合、高Fc 段結合活性、高抗體吸附量和性能穩(wěn)定等特點，可重復多次使用。
注意事項
1. 凝膠從冷室或冰箱中取出后在室溫下緩慢振搖恢復到室溫， 裝柱，避免產生氣泡影響柱效。
2. 裝柱時盡可能維持凝膠長徑比為5：3-2：1，長徑比過大將導致洗脫峰拖尾，洗脫體積增大；長徑比過小將導致樣品不填料接觸時間短，吸附丌充分，填料吸附蛋白量小。
3. 若上樣液中抗體濃度過高，應使用平衡緩沖液稀釋至 1-2mg/ml，以免上樣濃度過高影響柱效。
4. 可以采用降低上樣時的流速來增加樣品不填料接觸時間從而提高純化抗體量。
5. 凝膠用低pH緩沖液洗脫時間應盡可能短，洗脫后用中性緩沖液盡快中和至 pH 中性，以延長親和介質的使用壽命。
6. 洗脫后，應立刻用如中和緩沖液將收集到的抗體溶液中和到中性（pH7.4 左右），以利于維持抗體的生物活性，避免抗體失活。
7. 填料使用后應用0.1M 檸檬酸鈉緩沖液（pH3.0）做再生處理，長期采用的洗脫條件將縮短親和介質的使用壽命。
8. 其它柱再生處理方法：本產品使用10 次以上后先用20%乙醇洗5 個柱床體積，再用 70%乙醇洗脫5-10 個柱床體積，可洗脫脂類和疏水性較強的蛋白質，避免使親和介質的載量下降、干擾親和介質的應用效果。
操作步驟
I 緩沖液的準備
1. 平衡緩沖液：20mM 磷酸鹽緩沖液，150mM NaCl，pH 7.4-8.5。
2. 洗脫緩沖液：0.1M glycine, pH2.5-3.0。
3. 再生緩沖液：1M NaCl。
4. 中和緩沖液：1M Tris-Cl，pH9.0。
注意：
1）對于某些純化載量較少的抗體，可適當提高需平衡緩沖液中的鹽濃度（zui高可達3M）和pH 值（zui高可達8.2），以提高抗體和介質的吸附力。但是有時高pH會使雜蛋白吸附增加，使用者應根據(jù)實際使用狀況適當調節(jié)。
2）以上緩沖液使用前均需0.45μm濾膜過濾。
II 樣品的準備
1. 樣品用平衡緩沖液稀釋5-10倍，以保證樣品液的成分及pH和平衡緩沖液接近。若上樣體積過大，可以采取調節(jié)上樣液pH和鹽濃度的方式，使樣品的pH和電導不平衡液接近，并使樣品中的緩沖體系不平衡緩沖液相同。
2. 細胞培養(yǎng)液中大量的血清蛋白會對親和層析造成一定的干擾，去血清處理或稀釋樣品將提高純化抗體收率。
注意：樣品在上柱前需0.45μm微孔濾膜過濾。
III 操作步驟
1. 填料裝柱后，用超純水流洗3-5個柱床體積以洗掉乙醇，用平衡緩沖液流洗5-10個柱床體積平衡柱子。
2. 將樣品上柱，上樣流速60cm/h。
3. 平衡緩沖液再洗5-10個柱床體積，直至基線平穩(wěn)。
4. 洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰，用中和緩沖液將洗脫收集樣品中和到中性。
5. 立即用5-10個柱床體積平衡緩沖液平衡柱子到中性。
6. 再生緩沖液流洗3-5個柱床體積。先后用純水、20%乙醇分別流洗 3-5 個柱床體積。柱子置于4~8℃保存。
注意：操作中如果沒有實時的蛋白監(jiān)測系統(tǒng)，收集洗脫峰時可以分階段收集到多個管中，后根據(jù)測定結果重新調整收集方式。
實驗代做服務：
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